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bevictor伟德官网入口捕获探针设计
发布会时间:2023-12-28

NGS捕获探针应用与设计难点

在NGS全测序中,数据量庞大,数据分析困难。针对某些疾病或肿瘤相关的目的基因进行测序时,通常选择靶向捕获目标区域进行实验。这种方法测序成本更低,测序深度更高,数据有效率也更高,适用于检测SNP、InDel、CNV、Fusion等突变类型。


靶向捕获主要有两种方式:

1.多重PCR:

通用扩增子引物扩增的方式得到的基因片段,能有效富集目的片段,但单次实验的扩增子数量受限、设计难度高。

2.杂交捕获:

生物素修饰的探针通过碱基互补配对去捕获目的基因片段。当探针和目标区段杂交完成后,通过磁珠将探针吸附使得目的片段和非目标片段分开,对获得目的片段进行测序。相较于多重PCR,杂交捕获可检测变异类型多、大小panel都适用、探针对错配的容忍度高、检测范围广。


其中,具有良好捕获特异性和均一性的捕获探针设计成为了杂交捕获的关键。需要考虑的因素众多,包括GC含量、探针结构、区位等,因此,一款良好的探针设计软件非常重要!





bevictor伟德官网入口捕获探针设计

为了解决杂交捕获探针设计中面临的捕获特异性和均一性问题,bevictor伟德官网入口NGS团队结合经验,自主研发杂交捕获探针设计工具 Smartbaits,能够方便、高效、高质量的完成探针设计。



设计优势

1、多种识别方式:能够识别多种常见输入方式:bed格式文件,Fasta 文件格式,Gene Symbol 等。

2、优化的算法:综合考虑了探针的GC 平衡、特异性、探针之间的同源和异源二聚体,发卡结构等。使用更细的颗粒度寻找最佳探针方案,同时确保使用更少的探针达到覆盖度最大化,减少成本。

3、更加灵活的参数选择:可选择1x,2x tiling和overlap等不同的密度模式;可以选择不同的参考基因组或者目标序列,不仅限于常见模式生物或者人类基因组;根据序列特异性,极端GC以及二级结构区域对探针风险进行分级等。

4、灵活的设计方案:不同区间采用不同的方案。基因区间和间区、SNP骨架、MSI采用不同的优化算法进行设计。

5、可持续性:通过spike-in 的方式,可以在原有的panel中另外添加探针形成新的panel

6、使用灵活、门槛低:smartbaits采用SQL关系型数据库后端,以最小化需要高内存负载和大量I/O计算时间的数据文件问题。这使得用户可以快速使用多个不同的筛选标准重新分析,并最小化使用门槛。



设计原理

对于不同区域设计采用不同的方式设计。

1.普通区域设计:以中心对称原则,在滑窗可移动范围内寻找最佳探针集合。

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2.微卫星序列设计:大多微卫星序列较短,重复序列高,常规设计通常不能达到理想的捕获结果,因此采用优化的双端探针分别覆盖目标区域的两端的策略。

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设计流程

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输入质检

对于用户输入的内容转化为fasta序列进行质检分析,主要包括序列GC含量、Tm、序列复杂度分析等,将分析结果保存至数据库中。

1、输入

接受用户输入.bed文件格式、基因组.fasta或者gene symble 名称格式作为输入文件。普通设计为1x tiling,用户可以根据需要调整为2x tiling。程序会将输入的信息进行分析并保存在数据库当中。

2、输入质检

对于用户输入的内容转化为fasta序列进行质检分析,主要包括序列GC含量、Tm、序列复杂度分析等,将分析结果保存至数据库中。

3、设计探针

应用滑窗对候选目标区域进行分割,以探针长度为120 bp生成所有可能的探针,采用中心对称原则从左到右进行以step=1的步长生成候选探针集合。

4、探针筛选

分析所有的探针集合并质检。对每一个探针使用blastn 进行特异度分析,使用用户设置的参数通过决策树筛选探针集。主要决策点包括序列特异度、GC、Tm、二级结构等,得到最终探针集。

5、设计报告

设计完毕后会对探针进行风险分级:green 代表安全探针,保证捕获效率和特异性,yellow 代表有一定的特异度风险,black 代表特异性或者捕获效率较差,不建议添加。


最终生成三份结果:

1. 探针设计报告

含有探针覆盖度,探针数量等信息的PDF报告;

2. 通过探针信息(pass baits)

包括所有合格的探针信息,内含每一个探针的质检数据;

3. 所有探针信息(all baits)

含有所有的探针信息和质检数据,包括black、yellow探针。



性能对比

下表是使用bevictor伟德官网入口技术smartbaits和Ixx公司技术分别对基因KRAS、ALK、ROS1、EGFR、BRAF(CDS区)设计探针后进行杂交捕获实验结果对比。在downsample 到同等数据量下,bevictor伟德官网入口获得了更高的捕获效率,更高的平均测序深度,更低的fold80,并且达到了100%的 1x 覆盖度。

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应用范围

使用杂交捕获的靶向高通量测序技术可以应用于多种类型的研究,例如外显子组捕获,单核苷酸多态性(SNP),遗传性肿瘤检测,复杂疾病诊断,目的片段个性化捕获分析等。



使用方法

您可以通过邮件blg-mkt@bioligo.com、公众号私信或当地销售联系我们进行设计,Smartbaits未来也将在bevictor伟德官网入口官网上线,敬请期待!


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