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【专能优品】熔解曲线法解决方案(上)—熔解曲线荧光修饰
发布会时间:2024-04-08

多靶标检测是分子诊断技术领域重要应用之一,在多色荧光分析技术中,可检测靶标数受限于PCR仪荧光通道数。多色熔解曲线分析技术在多色荧光的基础上结合了熔解曲线法,增加了单一荧光通道可检测靶标数量,使可检测靶标数大大增加,具有通量大、操作简单、成本低、精度可靠等优点。

尽管如此,目前的多色熔解曲线分析技术仍面临着众多挑战,如:灵敏度低、特异性差、基线不平、倒峰、易突变模板不适用等。针对这些挑战,bevictor伟德官网入口结合底层技术方法创新,开发专能优品,形成修饰原料、酶、荧光标签三套熔解曲线解决方案。



熔解曲线法难点

1. FRE探针的荧光强度高度依赖于荧光基团和淬灭基团的距离和波谱重叠,探针序列长度受限(≦30 nt),Tm值调节困难

2. 非对称方法建立了荧光变化与Tm值的联系,但由于是线性扩增,扩增产量低,灵敏度低

3. 对称扩增是指数扩增,可以极大提高扩增产量,灵敏度高,但在建立荧光变化与Tm值二维联系上,存在技术难点




熔解曲线荧光探针解决方案

针对多色熔解曲线探针设计复杂、基线不平、倒峰、灵敏度低等问题,bevictor伟德官网入口基于非对称溶解曲线和对称熔解曲线分别设计了RQP系列荧光探针和RQ系列荧光探针,可在qPCR仪器常用通道中使用,适用于一管式多靶点检测,包括病原DNA多重,多联检等。




一、非对称熔曲荧光探针解决方案(RQP系列)


产品信息

RQP系列荧光探针由5'荧光修饰和3'RQP组成,常用的四个荧光通道可选用以下组合:

通道

修饰

5'

3'

FAM

BF490

RQP

VIC

BF533

ROX

BF590

Cy5

BF648



产品特点

1、探针设计灵活

RQP系列探针打破FRET探针长度限制、GC含量过高等问题,探针长度不受限,也无需分子信标设计,Tm调节更灵活,设计更简单。


2、熔曲检测结果

(1)熔曲峰高

避免因为熔曲峰过低而造成的误判

(2)避免“鼓包”

RQP探针发生碱基错配不会发生荧光变化,不会出现非特异熔曲峰,可有效避免非预期的“小鼓包”。

(3)基线平,无倒峰,判读更准确

RQP探针本身在扩增过程中和熔解曲线分析过程中都不会发生荧光变化,避免倒峰,同时使基线更加光滑平整,有助于准确判读。


下图为RQP探针和FRET探针熔解曲线测试对比图,RQP探针基线明显更平稳。

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RQP探针FRET探针



二、对称熔曲荧光探针(RQ系列)


产品信息

RQ系列荧光探针由5'荧光修饰和3'RQ组成,常用的四个荧光通道可选用以下组合:

通道

修饰

5'

3'

FAM

BF490

RQ

VIC

BF533

ROX

BF590

Cy5

BF648


产品特点

1、bevictor伟德官网入口专有技术,不涉及目前对称熔曲法任何专利


2、设计简便,无需针对熔曲的探针引物特殊设计,只需要采用bevictor伟德官网入口RQ修饰专有技术


3、熔曲检测结果

(1)灵敏度高,普适性好,降低漏检风险

RQ修饰不影响扩增,灵敏度与Taqman探针法相当,远高于不对称熔解曲线,每个靶标检测限均可达20copy/反应。

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6个靶标均为500 copy/反应

6个靶标均为50 copy/反应

6个靶标均为20 copy/反应

                                      如上图,蓝色为BF490/修饰探针,从左到右靶标为HPV 56型、59型、68型;绿色为BF533/修饰探针,从左到右靶标为HPV 35型、73型、51型



(2)熔曲峰高、峰形清晰,单通道多靶标区分明显

RQ探针在多个通道中均有较好的荧光变化,单个通道多种靶标能明显区分。

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          图为胃肠道病原体检测,蓝色为BF490/RQ修饰探针,从左到右靶标为CamJ、SalS、

          VibCO139、VibCO1、Brucella;绿色为BF533/RQ修饰探针,从左到右靶标为CloD、

          StaA、O157:H7、VibP、ShiS,靶标浓度均为500copy/反应。

                  图为HPV不同分型检测,蓝色为BF490/RQ修饰探针,从左到右靶标为HPV31、

                  HPV59、HPV18、HPV68 ;绿色为BF533/RQ修饰探针,从左到右靶标为HPV35、

                  HPV16、HPV51,靶标浓度均为500copy/反应。



(3)基线平稳,无倒峰,判读更准确








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